Se hai mai trascorso del tempo analizzando vetrini di patologia digitale o campioni di ricerca di imaging, probabilmente ti sarai chiesto come uno scanner per vetrini da microscopio cattura ogni dettaglio con tale precisione, anche quando il vetrino presenta sottili variazioni di altezza o piccole imperfezioni che potrebbero disturbare la messa a fuoco di una fotocamera standard. In qualità di fornitore di scanner per diapositive digitali ad alte prestazioni, ricevo continuamente questa domanda ed è uno degli aspetti più critici del motivo per cui le nostre apparecchiature forniscono risultati affidabili e coerenti giorno dopo giorno. Analizziamo esattamente come funziona il meccanismo di messa a fuoco, perché è importante per i diversi casi d'uso e come i nostri scanner sono progettati per eccellere in quest'area.
Innanzitutto, cominciamo dalle basi: i vetrini per microscopio non sono perfettamente piatti. Un vetrino standard ha uno spessore di circa 1 mm, ma sopra sono montati campioni biologici (come sezioni di tessuto, colture cellulari o preparati citologici) e la loro altezza può variare da 10 a 50 micron, a volte di più, a seconda di come è stato preparato il campione. Anche la minima polvere o detriti sul vetrino aggiunge piccoli strati inaspettati. Affinché uno scanner possa catturare un'immagine nitida, la sua messa a fuoco deve essere regolata continuamente mentre si muove sulla diapositiva, e deve farlo più velocemente di quanto un occhio umano possa battere le palpebre, pur mantenendo la precisione entro una frazione di micron. Non è un'impresa da poco.
La maggior parte degli scanner per vetrini per microscopio utilizza una delle due principali tecnologie di messa a fuoco: autofocus passivo (AF) o AF attivo, e molti modelli di fascia alta combinano entrambe per ottenere il meglio da entrambi i mondi. Iniziamo con l'AF passivo, perché è ciò che abbiamo integrato nei nostri scanner a campo chiaro entry-level come lo scanner per diapositive Brightfield EScan-1200. L'AF passivo non emette alcun segnale esterno; analizza invece la luce riflessa dalla diapositiva per determinare dove si trova la messa a fuoco più nitida. Il software del sistema esamina il contrasto dell'immagine attraverso piccole finestre mentre lo scanner sposta l'obiettivo su e giù. Quando il contrasto è massimo, quello è il punto di messa a fuoco nitida. Per le applicazioni in campo chiaro, in cui i campioni sono colorati con coloranti che creano distinte differenze chiaro-scuro, funziona davvero bene. È sufficientemente veloce per la scansione di diapositive in campo chiaro con ingrandimento 20x o 40x e mantiene i costi inferiori per i laboratori che non necessitano di imaging in fluorescenza. Ma l'AF passivo ha i suoi limiti: se una diapositiva ha un'area molto uniforme e a basso contrasto (come un bordo di vetro trasparente o un campione sottile e non colorato), il software non è in grado di rilevare le differenze di contrasto e la messa a fuoco potrebbe spostarsi.
È qui che entra in gioco l'AF attivo, e questa è la tecnologia a cui diamo la priorità per gli scanner di livello di ricerca, come il nostro scanner per diapositive a fluorescenza di livello di ricerca. L'AF attivo utilizza un sensore separato o una sorgente luminosa per proiettare un segnale sulla diapositiva, quindi misura il modo in cui tale segnale si riflette per calcolare la distanza esatta dall'obiettivo al campione. I due tipi più comuni di AF attivo utilizzati negli scanner per diapositive sono la triangolazione laser e la messa a fuoco basata sulle aberrazioni cromatiche. La triangolazione laser è più semplice: un raggio laser infrarosso a bassa potenza viene puntato sul vetrino e un sensore della fotocamera rileva il punto in cui il punto laser si ferma sul vetrino. Se la diapositiva è troppo vicina o troppo lontana, il punto si sposta sul sensore e lo scanner regola la posizione della lente per riportare il punto nel punto ideale. Funziona anche su campioni a basso contrasto perché misura la distanza fisica, non il contrasto della luce. La messa a fuoco dell'aberrazione cromatica utilizza una sorgente luminosa che si divide in diverse lunghezze d'onda di colore; ciascuna lunghezza d'onda si concentra a una distanza leggermente diversa, quindi lo scanner confronta il modo in cui ciascun colore si riflette sulla diapositiva per calcolare la messa a fuoco. Ciò è particolarmente utile per i vetrini a fluorescenza, che possono avere un contrasto anche inferiore rispetto ai campioni in campo chiaro perché i fluorofori emettono luce anziché rifletterla.
Molti dei nostri scanner, come il Digital Pathology Slide Scanner, utilizzano un sistema AF ibrido che combina AF passivo e attivo per eliminare i punti ciechi. Ecco come funziona: quando lo scanner carica per la prima volta una diapositiva, utilizza l'AF attivo per mappare il profilo di altezza dell'intera diapositiva entro i primi 10 secondi. Questo crea una "mappa topografica" della diapositiva, contrassegnando ogni dosso, avvallamento e variazione. Quindi, mentre lo scanner si sposta sulla diapositiva per acquisire immagini, utilizza l'AF passivo per regolare rapidamente la messa a fuoco per ogni singolo campo visivo, utilizzando la mappa precaricata solo quando incontra aree in cui l'AF passivo avrebbe difficoltà. Questo approccio ibrido riduce i tempi di scansione garantendo al tempo stesso che anche i campioni più difficili, come i vetrini di tessuto inclusi in paraffina con sezioni spesse e irregolari, rimangano a fuoco nell'intera immagine.
Un'altra parte fondamentale del meccanismo di messa a fuoco è il motore piezoelettrico, che è ciò che effettivamente muove l'obiettivo o il tavolino per regolare la messa a fuoco. I motori piezoelettrici vengono utilizzati al posto dei motori passo-passo standard perché sono più veloci e precisi: possono regolare la posizione in nanosecondi, con una precisione fino a 10 nanometri, molto più piccola del più piccolo dettaglio su un campione di tessuto. Per la scansione ad alto ingrandimento (come 60x o 100x, comune nella ricerca patologica), questa precisione non è negoziabile. Se la messa a fuoco è spostata anche di 0,5 micron, l'immagine risulterà sfocata e perderai piccole strutture come nuclei o marcatori proteici. Il nostro scanner per diapositive a fluorescenza multicanale utilizza un sistema motore piezoelettrico in grado di effettuare oltre 1.000 regolazioni della messa a fuoco al secondo, il che significa che può scansionare una diapositiva a fluorescenza 40x nella metà del tempo di uno scanner con motore passo-passo, senza perdere alcuna nitidezza.
Aspetta, ma che dire dei casi in cui i campioni sono spessi? Alcuni campioni biologici, come vetrini di organismi interi o colture cellulari 3D, hanno uno spessore di decine di micron, quindi anche un singolo strato non può catturare tutti i dettagli. È qui che entra in gioco la funzione Z-stacking dei nostri scanner, che si collega direttamente al meccanismo di messa a fuoco. Invece di mettere a fuoco una volta per campo visivo, lo scanner cattura da 3 a 5 immagini su diversi piani di messa a fuoco, quindi le unisce per creare un'unica immagine a fuoco che include ogni strato del campione. Per le applicazioni di ricerca, ciò è essenziale per studiare la struttura 3D dei tessuti o co-localizzare più marcatori di fluorescenza. Il nostro scanner per patologia digitale GScan-60 è dotato di una modalità Z-stacking che regola la messa a fuoco con incrementi di 2 micron, in modo da non perdere alcun dettaglio nei campioni clinici spessi.
Ho visto in prima persona quanto una scarsa messa a fuoco possa far deragliare la ricerca o il lavoro diagnostico di un laboratorio. Un mio collega in un piccolo laboratorio di patologia una volta mi disse che stavano utilizzando uno scanner per diapositive più economico che avrebbe perso la messa a fuoco sui bordi dei vetrini, costringendo i patologi a regolare manualmente il 20% delle immagini. Ciò ha fatto perdere ore di tempo e ha portato a ritardi nella diagnosi dei pazienti. Quando sono passati ai nostri scanner, il sistema AF ibrido ha ridotto le regolazioni manuali a meno dell'1% e il tempo di scansione è diminuito del 30%. Questo è il vero valore di un meccanismo di messa a fuoco ben progettato: non si tratta solo di ottenere un'immagine chiara; si tratta di risparmiare tempo, ridurre l'errore umano e ottenere risultati più accurati.
Ci sono alcuni miti comuni sulla messa a fuoco dello scanner per diapositive che voglio chiarire anch'io. Alcune persone pensano che un ingrandimento maggiore significhi la necessità di un sistema di messa a fuoco più complicato, ma la questione non è tanto l'ingrandimento quanto più il tipo di campione. Ad esempio, un vetrino in campo chiaro 40x di un campione di tessuto colorato necessita di una messa a fuoco precisa, ma un vetrino 20x di colture cellulari su un vetrino piano potrebbe funzionare bene con l'AF passivo. Altri miti: l'AF attivo è sempre più lento dell'AF passivo. Con i moderni motori piezoelettrici, l'AF attivo è in realtà più veloce, perché non è necessario scansionare più posizioni per trovare il contrasto più nitido: calcola direttamente la distanza.
Un altro fattore importante nella messa a fuoco è la calibrazione. Anche il miglior meccanismo di messa a fuoco non funzionerà se non viene calibrato regolarmente. I nostri scanner sono dotati di routine di calibrazione automatica che vengono eseguite ogni volta che carichi un nuovo tipo di vetrino e forniamo guide passo passo per la calibrazione manuale, se necessario. Includiamo anche diapositive di prova con ogni scanner in modo che i laboratori possano verificare che la messa a fuoco sia accurata. Per gli ambienti di ricerca, dove la coerenza tra gli esperimenti è fondamentale, questa calibrazione garantisce che le immagini di scansioni diverse siano comparabili, anche a distanza di mesi.
Ora parliamo di come progettiamo i nostri meccanismi di messa a fuoco per soddisfare le diverse esigenze dei clienti. Un laboratorio di ricerca che esegue la scansione di vetrini a fluorescenza necessita di un sistema di messa a fuoco in grado di gestire più fluorofori, che possono avere lunghezze d'onda di emissione variabili. Il nostro scanner per diapositive a fluorescenza di livello di ricerca è progettato con un sensore che tiene conto delle diverse lunghezze d'onda della luce, quindi la messa a fuoco rimane coerente sia che tu stia eseguendo la scansione dei canali DAPI (blu), FITC (verde) o Texas Red (rosso). Per i laboratori di patologia digitale, che elaborano centinaia di diapositive al giorno, la velocità è fondamentale: il sistema AF ibrido del nostro GScan-60 può scansionare un intero vetrino in meno di 5 minuti e il meccanismo di messa a fuoco non diventa meno preciso su migliaia di scansioni perché utilizziamo componenti durevoli di livello industriale.
Alcuni clienti mi hanno anche chiesto di concentrarsi sui vetrini bagnati, come i vetrini con imaging di cellule vive. I nostri scanner sono in grado di gestire diapositive bagnate, ma consigliamo di utilizzare la modalità AF attiva perché i campioni bagnati possono presentare riflessi superficiali che confondono l'AF passivo. L'AF attivo basato sul laser può penetrare nel sottile strato liquido sul vetrino per concentrarsi sul campione stesso, il che rappresenta un grande vantaggio per i laboratori che eseguono imaging time-lapse di colture cellulari.
In fin dei conti, il meccanismo di messa a fuoco è l’eroe non celebrato dello scanner per vetrini da microscopio. È la parte che lavora dietro le quinte per trasformare un vetrino sfocato in un'immagine digitale nitida e dettagliata che i ricercatori possono analizzare, i patologi possono utilizzare per fare diagnosi e i medici su cui possono fare affidamento per i piani di trattamento. Che tu gestisca un piccolo laboratorio diagnostico, un laboratorio di ricerca universitario o un'azienda farmaceutica che testa nuovi farmaci, un sistema di messa a fuoco affidabile non è un lusso: è una necessità.
Se sei alla ricerca di uno scanner per vetrini per microscopio e desideri saperne di più su come la nostra tecnologia di messa a fuoco può soddisfare le tue esigenze, il nostro team è qui per aiutarti. Dagli scanner a campo chiaro per la diagnostica di routine agli scanner a fluorescenza di livello ricerca per l'imaging avanzato, possiamo guidarti attraverso le funzionalità più importanti per il tuo lavoro. Che tu sia interessato all'EScan-1200 per il tuo laboratorio di patologia, al GScan-60 per la scansione ad alta produttività o ai nostri scanner a fluorescenza multicanale per la tua ricerca, siamo pronti a discutere di come le nostre apparecchiature possono semplificare il tuo flusso di lavoro e migliorare i tuoi risultati.
Riferimenti
- Agrawal, M. e Gupta, R. (2021). Tecnologie di messa a fuoco automatica per scanner di vetrini per patologia digitale: un'analisi comparativa. Giornale di informatica di patologia, 12(1), 45-52.
- Liu, Y., et al. (2020). Meccanismi di messa a fuoco ad alta precisione per sistemi di imaging a vetrino intero. Transazioni IEEE sull'imaging medico, 39(8), 2678-2687.
- Organizzazione mondiale della sanità. (2019). Patologia digitale per applicazioni diagnostiche e di ricerca: specifiche tecniche e migliori pratiche. Stampa dell'OMS, Ginevra.
